Идентификация и генотипирование вируса Чикунгунья с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

ВВЕДЕНИЕ

Вирус Чикунгунья (ЧИКВ), переносчиком которого являются комары рода Aedes, распространенные в странах с тропическим и субтропическим климатом, вызывает одноименное заболевание — лихорадку Чикунгунья, характеризующуюся острой лихорадочной реакцией, сыпью, миалгией и артралгией с риском возможной хронизации [1][2].

ЧИКВ относят к роду Alphavirus, семейству Togaviridae. Выделяют четыре генотипа вируса: Азиатский (Asian), Западно-Африканский (West African, WAf), Восточно-Центральный Южно-Африканский (East-Central-South African, ECSA) и Восточно-Центральный Южно-Африканский — линия Индийского океана (East-Central-South African — Indian Ocean Lineage, ECSA-IOL). Однако указанные генотипы не имеют четкой территориальной локализации, то есть на одной территории могут одновременно выявляться разные генотипы ЧИКВ [2–6]. Для детекции вируса в комарах или при лабораторном подтверждении клинического диагноза используют протокол, предложенный Центром по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention, CDC), с использованием праймеров к различным участкам генов структурных белков E1, Е2 и неструктурного белка nsP1 (non-structural protein 1) или коммерческих наборов реагентов для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени [2–10].

Генотипирование ЧИКВ проводится с помощью секвенирования участков генов, кодирующих белки Е1, Е2, реже nsP1, или секвенирования всего генома вируса [1–3][6][8][9][11][12].

При эпидемиологическом исследовании важно определение генотипа штамма вируса для выявления места источника инфицирования. Имеющиеся наборы реагентов или протокол проведения ПЦР не позволяют генотипировать вирус, а для секвенирования нуклеиновых кислот требуются дорогостоящее оборудование и материалы, что не всегда доступно.

Ранее для парамиксовирусов (вирусы эпидемического паротита и кори) и вируса краснухи было показано применение метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) для генотипирования, вплоть до быстрого определения конкретного штамма вируса [13–15].

В связи с этим вероятно предположить, что метод ПДРФ может быть применен и для генотипирования вируса ЧИКВ, что проводится впервые.

Цель работы — изучение возможности применения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для идентификации и генотипирования вируса Чикунгунья.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения исследования использовали РНК вирусов, относящихся к роду Alphavirus (ЧИКВ — по 3 штамма каждого из четырех генотипов, которые были предварительно определены секвенированием: Asian, ECSA, ECSA-IOL, WAf; вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей — 2 штамма; вирус Синдбис — 2 штамма) и семейству Flaviviridae (вирусы желтой лихорадки штамм 17D, денге 1–4 типов, японского энцефалита, Западного Нила, клещевого энцефалита — каждого по одному штамму).

Все работы проводили с соблюдением действующих санитарных норм. Штаммы, которые были использованы для получения РНК, находятся в коллекциях филиала ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России в Республике Никарагуа, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» и ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

Выделение РНК из образцов проводили с использованием комплекта реагентов «АмплиСенс® Магно-Сорб» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя. Экстракцию РНК выполняли в 50 мкл элюирующего раствора и хранили образцы при минус 70 °С до дальнейшего использования.

Получение кДНК из препаратов РНК. Реакционная смесь при проведении ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в объеме 60 мкл имела следующий состав: 10-кратный SE буфер M-MuLV — 6 мкл, смесь дНТФ (40 мМ) — 0,6 мкл, M-MuLV ревертаза (50 ед/мкл) — 1,4 мкл, специфический обратный праймер (24 пкмоль) — 8 мкл, РНК образца — 16 мкл, Н₂О — 28 мкл (все использованные реактивы производства ООО «СибЭнзайм», Россия). Реакцию осуществляли в течение 30 мин при 42 °C.

ПЦР-амплификация фрагментов ДНК длиной 648 п.н. проводилась в объеме 125 мкл. Данный объем реакционной смеси состоял из 25 мкл кДНК, специфических праймеров — по 5 мкл каждого (3 пкмоль/мкл), 12,5 мкл SE-буфера Tag ДНК полимеразы, 25 мкл Tag ДНК полимеразы (активность 5000 е.а./мл), смесь дНТФ (40мМ) — 1,5 мкл, Н₂О — 51 мкл (все использованные реактивы производства ООО «СибЭнзайм», Россия). Термоциклирование проводили в амплификаторе ДТпрайм 5М1 («ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: предварительный прогрев при 95 °C — 90 с, далее 35 циклов амплификации (95 °C — 20 с, 55 °C — 40 c, 72 °C — 40 с), при 72 °C — 10 мин, хранение — 10 °С. При рестрикционном анализе гидролиз осуществляли эндонуклеазами рестрикции DraI, PvuII и PspEI (ООО «СибЭнзайм», Россия). К 25 мкл смеси ПЦР после амплификации добавляли 5 мкл буфера для рестрикции ROSE (ООО «СибЭнзайм», Россия) и 20 мкл Н₂О, затем делили на две аликвоты по 25 мкл и к одной из них добавляли 1 мкл эндонуклеазы рестрикции. Вторую аликвоту использовали в качестве отрицательного контроля рестрикции. После инкубации в течение 1 ч при 37 °С продукты гидролиза разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия и визуализировали на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете.

При проведении ПЦР в качестве положительного контроля использовали рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую последовательность гена nsP2 ЧИКВ (кат. № D-1652 АО БТК «Биосервис», Россия).

Компьютерные программы. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей ЧИКВ осуществляли с использованием программы MAFFT version 7¹. Конструирование олигонуклеотидных праймеров проводили с помощью программы OLIGO 4.0².

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор фрагмента вируса Чикунгунья, пригодного для определения генотипа методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

Для ЧИКВ выбор фрагментов для дальнейшего использования метода ПДРФ осуществляли следующим образом:

• проводили множественное выравнивание 731 последовательности геномов ЧИКВ, для которых указан генотип в базе данных GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information)³;
• анализировали участки РНК, наиболее консервативные для каждого из четырех генотипов ЧИКВ;
• выбирали фрагмент, оптимальный для определения генотипа по наличию/отсутствию сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции;
• подбирали специфичные последовательности прямого и обратного праймеров для амплификации выбранного участка в геномах ЧИКВ.

Анализ нуклеотидных последовательностей геномов штаммов вируса Чикунгунья, представленных в базе данных GenBank, для дифференциации генотипов

Из базы данных GenBank были выбраны нуклеотидные последовательности всех генотипов ЧИКВ длиной не менее 10000 н. Всего рассмотрена 731 нуклеотидная последовательность. В результате было установлено, что фрагмент гена неструктурного белка 2 (nsP2) длиной 648 н. между позициями 3806 и 4453 (относительно референсного генома ЧИКВ, GenBank NC_004162⁴) содержит сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, наличие или отсутствие которых составляют различные комбинации для каждого из 4-х генотипов ЧИКВ. Из-за вариабельности структур РНК данного фрагмента были подобраны праймеры с вырождением, позволяющие амплифицировать целевой участок генома всех рассмотренных штаммов ЧИКВ путем проведения ОТ-ПЦР (табл. 1).

Анализ нуклеотидных последовательностей с помощью метода множественного выравнивания позволил установить, что в выбранном фрагменте гена nsP2 в зависимости от генотипа вируса могут содержаться сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции PspEI, PvuII и DraI (рис. 1, табл. 2).

Сайты рестрикции PspEI, PvuII и DraI не одинаково представлены у разных генотипов ЧИКВ (табл. 2). В позиции 350 данного фрагмента в случае штаммов генотипов Asian, ECSA и ESCA-IOL находится последовательность GGTТACC, которая расщепляется рестритазой PspEI (сайт узнавания GGTNACC) и отсутствует у штаммов генотипа WAf. При этом у штаммов генотипа ESCA-IOL в позиции 252 обнаружена единичная нуклеотидная замена цитозина (С) на тимин (Т), что привело к образованию второго сайта узнавания рестриктазой PspEI. Таким образом, расщепление ПЦР-продукта ферментом PspEI в случае штаммов генотипов Asian и ECSA должно привести к образованию двух фрагментов длиной 350 и 298 п.н., а для ESCA-IOL — к образованию трех фрагментов длиной 298, 252 и 98 п.н. В то же время расщепление ПЦР-продукта рестриктазой PspEI для штамма WAf не должно происходить. При анализе штаммов генотипов WAf, ECSA и ESCA-IOL обнаружена замена в положении 527 гуанина (G) на аденин (А), которая приводит к образованию последовательности CAGCTG и сайта узнавания для рестриктазы PvuII. При этом для генотипа WAf в результате замены А в позиции 226 на гуанин G в ДНК-фрагменте появляется еще один сайт узнавания PvuII. Генотип Asian не содержит сайтов узнавания PvuII. Таким образом, в случае штаммов Asian ПЦР-фрагмент гена nsP2 длиной 648 н. не может расщепляться PvuII, а для штаммов ECSA и ESCA-IOL гидролиз PvuII должен привести к образованию двух фрагментов длиной 527 и 121 п.н. В случае штаммов генотипа WAf ожидается образование трех фрагментов длиной 301, 226 и 121 п.н.

В геномах некоторых анализированных штаммов ЧИКВ генотипа ECSA (включая референсный NC_004162, GenBank) сайт PvuII в позиции 527 отсутствует. В этом случае различие генотипов ECSA и Asian может быть установлено с помощью расщепления ампликона ферментом DraI. Анализ методом множественного выравнивания позволил установить, что в позиции 403 данного фрагмента генотипа Asian находится сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции DraI, что должно привести к разделению ПЦР-продукта на два фрагмента — длиной 403 и 245 п.н. В случае трех других генотипов ЧИКВ в ДНК-фрагменте в позиции 408 вместо А находится G, в связи с чем ПЦР-продукт не может расщепляться эндонуклеазой рестрикции DraI.

Как следует из представленных в таблице 2 обобщенных данных, эндонуклеазы рестрикции PvuII и PspEI могут быть использованы для генотипирования ЧИКВ методом ПДРФ, а фермент DraI — для дифференциации генотипов ECSA и Asian.

Оценка специфичности праймеров

Для определения специфичности выбранных праймеров проводили ОТ-ПЦР c контрольной рекомбинантной плазмидой, несущей последовательность гена nsP2 вируса Чикунгунья. В ходе реакции был амплифицирован фрагмент длиной, соответствующей расчетной, — 648 п.н. При проведении ОТ-ПЦР с использованием в качестве матрицы РНК гетерологичных вирусов (раздел «Материалы и методы») продукт амплификации выявлен не был. Напротив, при постановке ОТ-ПЦР с РНК ЧИВК всех четырех генотипов амплифицирован фрагмент длиной, соответствующей расчетной, что свидетельствовало о специфичности выбранных праймеров в отношении всех существующих генотипов ЧИКВ.

Результаты ОТ-ПЦР с последующей рестрикцией эндонуклеазами PspEI, PvuII и DraI

Для апробации разработанного способа типирования ЧИКВ на основе ОТ-ПЦР и метода ПДРФ была использована РНК штаммов, относящихся к разным генотипам. При проведении гидролиза фрагмента гена nsP2 размером 648 п.н. с использованием эндонуклеаз рестрикции PspEI и PvuII в зависимости от генотипа ЧИКВ были получены фрагменты длиной, соответствующей расчетной (рис. 2).

Результаты рестрикции (рис. 2) четко визуализировались при электрофоретической детекции. При этом в случае штамма ЧИКВ генотипа WAf амплифицируемый фрагмент не расщеплялся рестриктазой PspEI, но при гидролизе рестриктазой PvuII образовывал три фрагмента, что соответствует двум сайтам рестрикции. Это позволило дифференцировать генотип WAf от других генотипов. В случае генотипа Asian исследуемый фрагмент не имел сайтов рестрикции PvuII, что в большинстве случаев позволяло отличить его от генотипа ECSA. Анализ ПЦР-продуктов генотипов ECSA и ECSA-IOL показал наличие одинаковых фрагментов при рестрикции ферментом PvuII, но при этом имелись четкие отличия при расщеплении рестриктазой PspEI.

Для дифференциации генотипов ECSA и Asian при проведении гидролиза фрагмента гена nsP2 размером 648 п.н. была использована эндонуклеаза DraI.

Анализ результатов (рис. 3) свидетельствует о том, что при проведении реакции были получены фрагменты длиной, соответствующей расчетной. В случае генотипов Asian и ECSA рестриктаза PspEI расщепляла ампликон на два фрагмента — 350 и 298 п.н. В то же время в случае генотипа ECSA амплифицированный фрагмент не гидролизовался эндонуклеазой рестрикции DraI, а при анализе генотипа Asian показано расщепление ПЦР-продукта с образованием двух фрагментов, длины которых соответствовали расчетным — 403 и 245 п.н. Таким образом, метод ПДРФ позволил провести дифференциацию между всеми изученными генотипами ЧИКВ, и результаты рестрикционного анализа совпали с данными, полученными путем секвенирования, которое было осуществлено ранее.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в работе результаты продемонстрировали, что в гене неструктурного белка nsP2 ЧИКВ находится фрагмент, имеющий сайты эндонуклеаз рестрикции, комбинация которых специфична для каждого генотипа вируса. Теоретически предсказано и экспериментально подтверждено, что метод ПЦР с обратной транскрипцией и последующий анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов позволяют провести определение генотипа вируса Чикунгунья. Исследование не требует продолжительного времени и использования высокотехнологичного оборудования. Полученные результаты в перспективе могут быть использованы для идентификации и генотипирования при исследовании биологического материала, подозрительного на наличие возбудителя лихорадки Чикунгунья.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Н.А. Нетесова — обоснование концепции исследования, формулирование идеи, обобщение результатов исследования, критический пересмотр текста рукописи; М.А. Абдурашитов — создание модели исследования, анализ и обобщение данных литературы, расчет праймеров, критический пересмотр текста рукописи; Т.Г. Самарцева — подготовка образцов, проведение экспериментов, написание текста рукописи; О.В. Климович — подготовка образцов, проведение экспериментов; А.С. Оксанич — планирование исследования, редактирование текста рукописи; Е.В. Отрашевская — обобщение результатов исследования, редактирование текста рукописи; Г.М. Игнатьев — обоснование концепции исследования, планирование исследования, проведение экспериментов, написание текста рукописи.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. N.A. Netesova substantiated the study concept, formulated the study idea, summarised the study results, and critically revised the manuscript. M.A. Abdurashitov created the research model, analysed and summarised literature data, calculated the primers, and critically revised the manuscript. T.G. Samartseva prepared samples, conducted experiments, and drafted the manuscript. O.V. Klimovich prepared samples and conducted experiments. A.S. Oksanich planned the study and edited the manuscript. E.V. Otrashevskaia summarised the study results and edited the manuscript. G.M. Ignatyev substantiated the study concept, planned the study, conducted experiments, and drafted the manuscript.