Разработка защитной среды высушивания и режима лиофилизации для стабилизации диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового

Практическое применение эритроцитарных диагностических препаратов выявило недостатки, связанные с их транспортировкой на значительные расстояния с возможным несоблюдением режимов холодовой цепи, что может привести к полной потере их биологической активности. Для стабилизации основных свойств жидких форм эритроцитарных диагностических препаратов в настоящее время необходима разработка технологии получения лиофилизированных форм диагностикумов, которая позволит сохранить первоначальные свойства препарата в течение длительного времени. Цель работы: разработка защитной среды высушивания и режима лиофилизации для стабилизации диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового. Материалы и методы: были использованы вспомогательные вещества для подготовки защитных сред (желатин, тиомочевина, трегалоза, сахароза, декстран, твин 80). Для контроля чувствительности и специфичности лиофилизированных диагностикумов использовали 9 штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов разных родов и видов. При изучении стабильности основных показателей качества препаратов для диагностики in vitro (внешний вид высушенного препарата; потеря в массе при высушивании; растворимость, внешний вид восстановленного препарата; внешний вид препарата после отстаивания; чувствительность; специфичность) учитывали температуры различных климатических зон, в которых предполагается их реализация и использование. Результаты: разработаны и использованы стабилизирующие защитные среды с различным составом, с последующей сублимационной сушкой препарата и постановкой контрольных исследований. Наиболее перспективной признана среда высушивания для эритроцитарных диагностикумов, содержащая в своем составе меньшее количество ингредиентов — 6% декстрана, 0,06% твин 80 и азид натрия до 0,01%, как наиболее простая в исполнении и обеспечивающая полное сохранение качественных показателей препарата. Отработан рентабельный 12–14-часовой режим лиофилизации. Выводы: по совокупности полученных результатов изучения стабильности в реальном времени (долговременная стабильность) и ускоренном исследовании стабильности лиофилизированных форм диагностикума показана возможность хранения в течение двух лет при регламентированной температуре от 2 до 8 °С, а также в условиях повышенных и пониженных температур при 30±2 °С и минус 18 °С соответственно. Отрицательного влияния указанных температур на результаты контролируемых показателей не выявлено.

1. Ираклионова НС, Сысуев ЕБ, Мась ЕС. Природные очаги опасных и особо опасных возбудителей инфекционных заболеваний. Туляремия. Успехи современного естествознания. 2013;(9):118–9.

2. Кудрявцева ТЮ, Попов ВП, Мокриевич АН, Куликалова ЕС, Холин АВ, Мазепа АВ и др. Эпизоотолого-эпидемиологическая ситуация по туляремии на территории России в 2020 г., прогноз на 2021 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2021;(1):32–42. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2021-1-32-42

3. Старцева ОЛ, Курчева СА. Прогнозирование сроков годности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих туляремийных сухих. Здоровье населения и среда обитания – ЗНиСО. 2019;(2):56–60.

4. Тюменцева ИС, Афанасьев ЕН, Алиева ЕВ, Курчева СА, Гаркуша ЮЮ. Антигены и антисыворотки F. tularensis: к вопросу иммунодиагностики туляремии. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2012;1:49–52.

5. Жарникова ИВ, Жданова ЕВ, Жарникова ТВ, Старцева ОЛ, Курчева СА, Геогджаян АС и др. Сравнительная характеристика биотехнологии получения эритроцитарных и латексных диагностикумов для выявления возбудителя туляремии. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2019;15(4):27–31.

6. Жарникова ИВ, Ефременко ВИ, Жарникова ТВ, Курчева СА, Кальной СМ, Ефременко ДВ и др. Серологические методы выявления возбудителя туляремии и их оценка. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019;(4):32–8. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-4-32-38

7. Кошкидько АГ, Курчева СА, Жарникова ИВ, Старцева ОЛ. Разработка защитной среды высушивания для стабилизации эритроцитарного антигенного диагностикума. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2020;16(4):12–6.

8. Жученко МА, Пашкова МА, Потапенко ОВ. Лиофилизация биопрепаратов в двухкамерных шприцах. Биотехнология. 2015;(4):79–84.

9. Мустафина ЭН, Мустафин ТР, Садыков НС, Юсупов СА. Способы хранения культур Clostridium botulinum. Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. 2017;229(1):27–30.

10. Jena S, Krishna Kumar N, Aksan A, Suryanarayanan R. Stability of lyophilized albumin formulations: role of excipient crystallinity and molecular mobility. Int J Pharm. 2019;569:118568. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2019.118568

11. Piszkiewicz S, Pielak GJ. Protecting enzymes from stress-induced inactivation. Biochemistry. 2019; 58(37):3825–33. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.9b00675

12. Manohar P, Ramesh N, Improved lyophilization conditions for long-term storage of bacteriophages. Sci Rep. 2019;9(1):15242. https://doi.org/10.1038/s41598-019-51742-4

13. Жарникова ИВ, Кошкидько АГ, Курчева СА, Жданова ЕВ, Старцева ОЛ, Тюменцева ИС и др. Способ приготовления эритроцитарного диагностикума иммуноглобулинового туляремийного. Патент Российской Федерации № 2747420; 2021.

14. Chang BS, Kendrick BS, Carpenter JF. Surface-induced denaturation of proteins during freezing and its inhibition by surfactants. J Pharm Sci. 1996;85(12):1325–30. https://doi.org/10.1021/js960080y

15. Crowe JH, Carpenter JF, Crowe LM, Anchordoguy TJ. Are freezing and dehydration similar stress vectors? A comparison of modes of interaction of stabilizing solutes with biomolecules. Cryobiology. 1990;27:219–31. https://doi.org/10.1016/0011-2240(90)90023-W

16. Prestrelski SJ, Arakawa T, Carpenter JF. Separation of freezing- and drying-induced denaturation of lyophilized proteins using stress-specific stabilization: II. Structural studies using infrared spectroscopy. Arch Biochem Biophys. 1993;303(2):465–73. https://doi.org/10.1006/abbi.1993.1310

17. Carpenter JF, Prestrelski SJ, Arakawa T. Separation of freezing- and drying-induced denaturation of lyophilized proteins using stress-specific stabilization: I. Enzyme activity and calorimetric studies. Arch Biochem Biophys. 1993;303(2):456–64. https://doi.org/10.1006/abbi.1993.1309

18. Crowe LM, Reid DS, Crowe JH. Is trehalose special for preserving dry biomaterials? Biophys J. 1996;71(4):2087–93. https://doi.org/10.1016/S0006-3495(96)79407-9

19. Izutsu K, Yoshioka S, Kojima S. Increased stabilizing effects of amphiphilic excipients on freeze-drying of lactate dehydrogenase (LDH) by dispersion into sugar matrices. Pharm Res. 1995;12(6):838–43. https://doi.org/10.1023/A:1016252802413

20. Han Y, Jin BS, Lee SB, Sohn Y, Joung JW, Lee JH. Effects of sugar additives on protein stability of recombinant human serum albumin during lyophilization and storage. Arch Pharm Res. 2007;30(9):1124–31. https://doi.org/10.1007/BF02980247

21. Bolje A, Gobec S. Analytical techniques for structural characterization of proteins in solid pharmaceutical forms: an overview. Pharmaceutics. 2021;13(4):534. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13040534

22. Грачева ИВ, Осин АВ. Механизмы повреждений бактерий при лиофилизации и протективное действие защитных сред. Проблемы особо опасных инфекций. 2016;(3):5–12. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-3-5-12

23. Охапкина ВЮ. Методы поддержания микробных культур. Часть 2. Лиофилизация. Теорeтическая и прикладная экология. 2009;(4):21–32.